Biotecnologie per la Medicina Molecolare - 40 Ciclo

Background 

Il cancro del colon-retto (CRC) è la terza neoplasia più diffusa in Italia con circa 35.000 nuovi casi all’anno. Sebbene negli ultimi anni l’approccio alla terapia del CRC si sia spostato verso una terapia mirata (es. l’inibizione dei recettori dei fattori di crescita), questa strategia terapeutica è limitata dal fatto che i marcatori per la selezione dei pazienti e i target specifici di terapia clinicamente validati sono pochi. Attualmente lo standard terapeutico è ancora basato principalmente sulla chemioterapia (I e II linea) la cui efficacia è spesso limitata dall’insorgenza di resistenza. Le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione, sulle quali si sono basati i progetti di consorzi come The Cancer Genome Atlas (TCGA), hanno identificato migliaia di mutazioni e fusioni uniche tra vari tipi di cancro, ma solo una frazione di queste varianti è stata caratterizzata funzionalmente. Alla luce di ciò, una sfida fondamentale nello sviluppo e nell’implementazione di terapie antitumorali e nel miglioramento della cura dei pazienti è quella di distinguere le mutazioni “driver” causali dalle varianti “passenger” non patogene e chiarire i loro meccanismi oncogenici. Pertanto, esiste un urgente bisogno di caratterizzare funzionalmente le varianti tumorali di significato sconosciuto (VUS) in modo sistematico, così da chiarire sia il loro contributo allo sviluppo del cancro e sia le loro proprietà teranostiche per una terapia mirata. 

Scopi 

L'obiettivo del progetto di ricerca proposto consiste nella validazione funzionale di una serie di nuove varianti somatiche con significato incerto (VUS), già identificate dal nostro gruppo di ricerca in una coorte di 36 pazienti con cancro del colon-retto, determinando il loro effetto sulla funzione proteica e di conseguenza il loro ruolo nella patogenesi del CRC. 

Metodi 

Il nostro gruppo di ricerca ha già condotto un'analisi NGS per l'identificazione dei geni coinvolti nell'insorgenza e/o nella resistenza ai farmaci del CRC, utilizzando il pannello ad ampliconi AmpliSeqTm Comprehensive Cancer Panel che consente il sequenziamento dell'intera regione codificante di 409 geni associati a tumori. Questa analisi ha identificato varianti potenzialmente patogene in circa 350 geni, inclusi i geni che codificano per i recettori tirosin chinasici appartenenti alla famiglia dei recettori FGF (FGFR2, 3 e 4). In particolare, il gene FGFR2 è risultato essere mutato in 3/36 tumori (9%), mentre i geni FGFR3 e FGFR4 ciascuno in 7/36 tumori (20%). Queste mutazioni erano presenti esclusivamente nel tessuto tumorale e annotate come “dannose”, quindi potenzialmente oncogene, da due diversi software di predizione strutturale e funzionale delle proteine (Sift, Poliphen). Le sequenze wild-type di FGFR2, FGFR3 e FGFR4 verranno clonate in appropriati vettori di espressione plasmidici. Una volta clonate, le nuove mutazioni identificate nella coorte di pazienti verranno riprodotte nella sequenza codificante dei geni mediante un approccio di mutagenesi sito-specifico. Le mutazioni saranno testate mediante saggi di vitalità cellulare in vitro dipendenti da fattori di crescita (mutazioni vs wild-type) utilizzando i modelli cellulari Ba/F3 e MCF10A. Sulla base di questi risultati, la mutazione verrà annotata in tre diverse categorie funzionali: positiva (maggiore vitalità cellulare), nessun effetto e negativa (minore vitalità cellulare). Verrà valutato il livello di concordanza tra le annotazioni funzionali risultanti con le predizioni effettuate dai principali algoritmi computazionali 3D. Infine, verrà condotto un profilo proteomico funzionale delle mutazioni selezionate mediante array di proteine a fase inversa (RPPA) con l'obiettivo di identificare aberrazioni delle vie di segnalazione che stanno a valle delle mutazioni. 

Risultati attesi 

Ci aspettiamo di caratterizzare funzionalmente le varianti a significato sconosciuto (VUS) identificate in pazienti con cancro del colon-retto, al fine di identificare mutazioni “driver” che potrebbero avere effetti funzionali sullo sviluppo del cancro e sulla risposta ai farmaci (gli FGFR sono potenzialmente coinvolti nella resistenza ai farmaci e specifici inibitori della chinasi, come il dovitinib, sono attualmente oggetto di sperimentazione in studi clinici). Inoltre, l’identificazione di eventuali aberrazioni delle vie di segnalazione dipendenti dalle mutazioni, che verranno saggiate mediante profilo proteomico, ci aspettiamo di ottenere altri bersagli azionabili suscettibili ad una terapia mirata.