La sepsi si rimane una causa significativa di mortalità e morbidità, superando insufficienza cardiaca o tumori, nonostante ricerche approfondite e progressi clinici. La proteina pancreatica stone/regenerating protein (PSP/reg) sembra essere un promettente biomarcatore prognostico in pazienti in terapia intensiva post-intervento chirurgico. I livelli di PSP sono stati strettamente correlati alla gravità dell'infezione in pazienti chirurgici e traumatologici, offrendo una possibile discriminazione tra risposte infiammatorie settiche e non infettive. Sebbene l'interazione di PSP con i granulociti e il suo ruolo nella loro attivazione siano stati dimostrati, i meccanismi molecolari sottostanti e il suo impatto sul sistema immunitario innato rimangono poco chiari. 

Questo studio mira a reclutare 70 pazienti sottoposti a chirurgia addominale. Saranno raccolti campioni di sangue pre e post-operatori per misurare i livelli di PSP, proteina C-reattiva (CRP) e globuli bianchi (WBC). Saranno raccolti campioni basali per l'analisi, compresi PSP, CRP, WBC e altri parametri di routine. Verranno registrati anche dati aggiuntivi come età, genere, altezza, peso, BMI, diabete mellito ed Euroscore II. Criteri di esclusione: sepsi preesistente, età minore di 18 anni, malattie infiammatorie croniche, alterazioni del sistema immunitario, pancreatiti acute e croniche. 

L'endpoint primario è l'andamento dei livelli sierici di PSP prima e dopo l'intervento chirurgico elettivo, compresi i livelli basali, intraoperatori e a 24/48/72 ore dopo l'intervento. Gli endpoint secondari includono la valutazione dei livelli di PSP in assenza/presenza di infezione e addome aperto, confrontati con i marcatori di infiammazione di routine. 

Lo studio mira a valutare come PSP interagisce con i granulociti e influenza la loro attivazione. Si propone di esplorare i meccanismi attraverso i quali PSP influisce sul sistema immunitario innato. L'analisi delle sequenze del gene reg e del gene del recettore di PSP identificherà polimorfismi associati a risposte immunitarie anomale. Lo studio analizzerà anche le varianti genetiche e il loro potenziale impatto sui processi biochimici. 

La sepsi post -chirurgica rappresenta ancora oggi la principale causa di morte nei pazienti chirurgici. Strumenti diagnostici affidabili, come PSP come marcatore prognostico, possono portare a un intervento precoce e modifiche alle linee guida riguardo all'amministrazione di antibiotici. La caratterizzazione molecolare e genetica di PSP potrebbe facilitare terapie mirate per i pazienti in condizioni critiche, migliorando i loro esiti. I risultati dello studio contribuiranno a strategie personalizzate, riducendo in ultima analisi la morbilità e la mortalità correlate alla sepsi si nei pazienti chirurgici. 

La chirurgia addominale richiede l'identificazione precisa e la manipolazione di punti di riferimento anatomici per garantire risultati ottimali. Questo progetto mira a sfruttare le tecniche di apprendimento automatico per sviluppare un sistema in grado di identificare automaticamente i punti di riferimento anatomici nella chirurgia addominale, assistendo i chirurghi nella navigazione e migliorando la precisione chirurgica. 

Obiettivi: 

• Sviluppare un algoritmo di apprendimento automatico per rilevare e localizzare con precisione i punti di riferimento anatomici chiave nelle immagini chirurgiche addominali. 
• Esplorare diverse tecniche di apprendimento automatico, come reti neurali convoluzionali (CNN), macchine a vettori di supporto (SVM) e foreste casuali, per l'identificazione dei punti di riferimento. 
• Migliorare la pianificazione chirurgica analizzando le immagini preoperatorie e identificando i punti di riferimento correlati ai risultati chirurgici. 
• Integrare il sistema sviluppato negli strumenti di navigazione chirurgica per fornire una guida intraoperatoria in tempo reale basata sulla localizzazione dei punti di riferimento. 

Metodologia: 

• Raccogliere un dataset diversificato di immagini chirurgiche addominali, inclusi scansioni di tomografia computerizzata (TC), scansioni di risonanza magnetica (RM) e immagini intraoperatorie. 
• Annotare le immagini con etichette di verità sul terreno che indicano le posizioni dei punti di riferimento anatomici, come vasi principali, organi e strutture anatomiche importanti. 

Rilevamento dei punti di riferimento: 

• Preelaborare i dati dell'immagine, inclusi ridimensionamento, normalizzazione e tecniche di ingrandimento. 
• Implementare e addestrare modelli di apprendimento automatico, come CNN, per apprendere le caratteristiche spaziali e i modelli dei punti di riferimento anatomici. 
• Valutare e ottimizzare i modelli utilizzando misure di prestazione appropriate, come precisione richiamo e punteggio F1. 

Pianificazione chirurgica e analisi dei risultati: 

• Analizzare i punti di riferimento identificati nelle immagini preoperatorie e correlarli ai risultati chirurgici, come tassi di complicazioni, tempo operatorio e recupero del paziente. 
• Identificare caratteristiche specifiche dei punti di riferimento che sono indicative di risultati chirurgici positivi e utilizzarle per la pianificazione chirurgica e la presa di decisioni. 

Guida intraoperatoria: 

• Sviluppare un'interfaccia per integrare il modello addestrato nei sistemi di navigazione chirurgica. 
• Implementare il rilevamento in tempo reale dei punti di riferimento e sovrapporre i risultati sulle immagini intraoperatorie in diretta per guidare i chirurghi durante la procedura. 
• Valutare l'accuratezza e l'usabilità del sistema in un ambiente simulato o clinico. 

Risultati e valutazione: 

• Valutare quantitativamente le prestazioni dei modelli di apprendimento automatico sviluppati nel rilevamento dei punti di riferimento, confrontandoli con le annotazioni di verità sul terreno. 
• Valutare l'impatto del sistema sulla precisione chirurgica, l'efficienza della navigazione e i risultati dei pazienti attraverso studi comparativi e feedback clinico. 
• Analizzare l'efficienza computazionale e la scalabilità del sistema per garantirne l'implementazione pratica in contesti chirurgici reali. 

Discussione e conclusione: 

• Discutere i vantaggi e i limiti dell'utilizzo dell'apprendimento automatico per l'identificazione dei punti di riferimento anatomici nella chirurgia addominale. 
• Evidenziare l'impatto potenziale del sistema sviluppato nel miglioramento della precisione chirurgica, nella riduzione delle complicazioni e nell'aumento della sicurezza del paziente. 
• Fornire indicazioni sulle future direzioni di ricerca e opportunità per ulteriori miglioramenti nel campo della chirurgia addominale assistita dall'apprendimento automatico. 

Considerazioni etiche: 

• Affrontare le considerazioni etiche relative alla privacy dei dati, al consenso del paziente e all'uso responsabile degli algoritmi di apprendimento automatico nella pratica chirurgica. 
• Assicurare la conformità alle pertinenti normative, come la protezione dei dati e le normative sui dispositivi medici. 

Sfruttando gli algoritmi di apprendimento automatico per l'identificazione dei punti di riferimento anatomici nella chirurgia addominale, questo progetto mira a rivoluzionare la pratica chirurgica, portando a migliori risultati per i pazienti, maggiore precisione chirurgica e minori rischi operatori. 

L'immunoterapia con inibitori del checkpoint immunitario (ICI) è diventata la terapia di prima linea per i pazienti con melanoma metastatico. Tuttavia, la resistenza ai farmaci intrinseca o acquisita si verifica nella maggior parte dei pazienti con melanoma principalmente a causa della riprogrammazione verso un fenotipo immunosoppressivo del microambiente tumorale (TME). Negli ultimi anni i miRNA sono emersi come orchestratori della resistenza alla terapia nel melanoma e questo ha profonde implicazioni sia per scopi terapeutici che diagnostici. Sfruttando un profilo miRNA-seq basato su campioni di sangue di 48 pazienti con melanoma raccolti prima della terapia di prima linea con ICI, abbiamo identificato i miRNA circolanti in grado di distinguere i pazienti responder (R) vs non-responder (NR) all'immunoterapia. Le analisi bioinformatiche suggeriscono che questi miRNA governano potenzialmente pathway molecolari associati alla riprogrammazione del TME. Colpire queste alterazioni utilizzando miRNA terapeutici può rappresentare una nuova strategia per potenziare l’immunoterapia nel melanoma. L'enfasi principale del progetto sarà diretta al targeting dei miRNA oncogenici mediante oligonucleotidi antisenso (LNA) che saranno progettati per inibire l'espressione dei miRNA candidati nelle cellule di melanoma. Ciò consentirà di studiare il potenziale impatto biologico di questo targeting su diversi comportamenti cellulari, come la proliferazione, la migrazione, l'invasione e altri. Sarà inoltre validata la potenzialità dell'inibizione dei miRNA per migliorare l'immunoterapia in vitro e in vivo utilizzando a) sistemi di co-colture eb) modelli immunocompetenti che saranno trattati con la combinazione dell’immunoterapia più gli LNA. 

Non tutti i tumori hanno la stessa propensione a dare metastasi. In alcuni casi le metastasi si formano solo dopo molto tempo, in altri invece la progressione è veloce e le metastasi sono già presenti quando i pazienti manifestano i primi sintomi e viene formulata la diagnosi. Gli steps della cascata metastatica prevedono il distacco delle cellule tumorali dal massa primitiva, l’invasione del tessuto circostante, l’infiltrazione del circolo sanguigno e/o linfatico, la sopravvivenza in circolo delle cellula tumorali, e la colonizzazione di un sito secondario (sito metastatico). Tutte queste fasi sono accompagnate da un cambio di identità trascrizionale, proteica nonché metabolica della massa tumorale, che influenza il destino e il comportamento delle cellule tumorali, verso una natura solitamente più aggressiva. Tuttavia, questi stessi cambiamenti possono innescare una risposta immunitaria antitumorale e come tali rendere le stesse lesioni più aggredibili dal sistema immunitario. I meccanismi alla base dei vari steps della metastasi sollevano ancora diverse domande e questioni irrisolte, che questo progetto intende affrontare attraverso una combinazione di approcci di biologia cellulare (colture 2D e 3D, organoidi), biologia molecolare (NGS, citofluorimetria, live imaging) e computazionali. 

Le domande specifiche a cui vorremmo dare risposte sono: 

• Quali sono i meccanismi molecolari che controllano la capacità delle cellule di staccarsi dalla matrice extracellulare e vivere in condizioni di non aderenza? 
• In che modo le perturbazioni del microambiente tumorale influenzano l'acquisizione di queste capacità e quindi il successo del processo metastatico? Ci concentreremo in particolare sui meccanismi molecolari che mediano l’alterazione dell’espressione genica, il ruolo dei metabolismo, la funzionalità mitocondriale, interazione delle cellule tumorali con le cellule del sistema immunitario. 
• Quali tra i meccanismi alla base della cascata metastatica sono comuni a tutti i tipi di tumore e quali risultano invece tumore-specifici? 

La paralisi sopranucleare progressiva (PSP) è una malattia rara neurodegenerativa a esordio tardivo con paralisi sopranucleare dello sguardo, instabilità posturale, rigidità progressiva e demenza moderata. Sono state descritte 5 varianti cliniche, con correlazioni clinico-patologiche: la PSP classica (sindrome di Richardson) e 4 varianti atipiche di PSP, ovvero la PSP-parkinsonismo (PSP-P), la PSP-acinesia pura con congelamento della marcia (PSP-PAGF), la PSP-sindrome corticobasale (PSP-CBS) e la PSP-afasia non fluente progressiva (PSP-PNFA). La sindrome di Richardson è la variante clinica più comune. La PSP è caratterizzata dal punto di vista neuropatologico dalla perdita neuronale, dalla gliosi con placche astrocitiche e dal deposito di grovigli neurofibrillari tau-immunoreattivi in specifiche aree cerebrali. L'entità e la localizzazione delle aree d'accumulo delle proteine tau-fosforilate variano a seconda delle cinque varianti cliniche. La PSP è una taupatia 4R caratterizzata da una preponderanza di isoforme tau a quattro ripetizioni (esone 10 positivo) e da un quadro biochimico caratteristico (doppietto di tau 64 e tau 69) soprattutto a carico dei neuroni, degli astrociti e degli oligodendrociti. La PSP è anche caratterizzata dal deficit di diversi neurotrasmettitori (ad es. quelli dopaminergico, colinergico, gabaergico). Non sono noti i fattori che danno origine alla tau-neurodegenerazione. Le diagnosi differenziali si pongono con la malattia di Parkinson e con gli altri disturbi parkinsoniani atipici (APD), come l'atrofia sistemica multipla e la degenerazione corticobasale. La proteina tau è codificata del gene MAPT e nel cervello umano adulto sono espresse diverse isoforme di tau associate ai microtubuli e dunque coinvolte nel mantenimento della struttura del citoscheletro. Ad oggi, le taupatie sono ancora malattie incurabili e ciò rende necessari ulteriori studi non solo clinici ma anche molecolari per comprendere le caratteristiche patologiche e identificare biomarcatori specifici al fine di consentire una diagnosi precoce e sviluppare strategie terapeutiche mirate. L’obiettivo di questo studio è quello di ricapitolare le principali caratteristiche patologiche che sottendono la PSP e studiare i meccanismi molecolari e cellulari caratterizzanti la neurodegenerazione, quale la distribuzione sequenziale della tau-4R. A tal fine, il progetto si propone di creare un sistema di organoidi cerebrali a partire da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) generate da tre pazienti affetti da PSP-RS. Tali sistemi 3D consentono di ricreare le caratteristiche anatomiche salienti e le funzionalità di specifiche strutture del cervello umano, rappresentando dunque un modello valido per lo studio dei meccanismi molecolari alla base della malattia. Durante il progetto, saranno misurati la massa e il metabolismo degli organoidi cerebrali e saranno condotte analisi di immunofluorescenza con anticorpi contro specifiche modificazioni post-traduzionali della proteina tau (fosforilazione, troncamento e cambiamenti conformazionali) per identificare fenotipi molecolari rilevanti per lo sviluppo e la progressione della PSP. Il progetto prevede inoltre studi di trascrittomica comparativa (organoidi PSP vs. organoidi generati da soggetti sani) a livello di cellula singola mediante analisi di single cell RNA-seqencing (scRNA-seq) a tre diversi stadi di maturazione (30 gg, 60 gg e 90 gg) al fine di studiare la traiettoria di sviluppo dalle cellule progenitrici ai neuroni maturi e quindi identificare specifici sottotipi, molecolarmente distinti, di neuroni e i processi biologi ad essi associati. Nel suo insieme il progetto si pone quindi l’obiettivo di far luce sugli eventi precoci e tardivi associati alla patogenesi e degenerazione neuronale nella taupatia PSP.

Progetto

Caratterizzazione molecolare e funzionale del network di non-coding RNA che regola il sistema di “controllo di qualità mitocondriale” nei tumori umani

Descrizione

L’omeostasi cellulare è finemente regolata dai mitocondri, non più considerati organelli statici esclusivamente deputati alla produzione di energia, bensì strutture altamente dinamiche che cambiano forma, numero e localizzazione subcellulare attraverso meccanismi altamente regolati che definiscono il cosiddetto “sistema di controllo di qualità mitocondriale”.

Difetti in tale sistema sono stati implicati nei meccanismi di tumorigenesi. In questo progetto, intendiamo caratterizzare il network di non-coding RNA che promuove nuove vulnerabilità nel sistema di qualità mitocondriale nei tumori umani.

Le cellule tumorali modificano il loro metabolismo per soddisfare le richieste bioenergetiche, biosintetiche e redox, necessarie per il mantenimento di cellule altamente proliferanti. Tuttavia, la riprogrammazione metabolica delle cellule tumorali crea vulnerabilità metaboliche che possono essere colpite da un punto di vista terapeutico. 

I tumori solidi possono presentare una varietà di cambiamenti metabolici caratteristici, tra cui l'aumento della glicolisi aerobica, l'aumento della sintesi de novo di acidi grassi, il consumo di glutammina, uno squilibrio del metabolismo ossidativo, che contribuiscono collettivamente alla rapida crescita e proliferazione delle cellule tumorali fornendo energia e materie prime per la biosintesi di macromolecole. 

I meccanismi di adattamento metabolico alterano l'equilibrio dei processi sia anabolici che catabolici come la glicolisi, la fosforilazione ossidativa (OXPHOS), la glutaminolisi, l'ossidazione dei lipidi e la sintesi di lipidi/nucleotidi/proteine, in un modo che dipende dai livelli di nutrienti disponibili, dai livelli di energia, dalla concentrazione di ossigeno in un microambiente ostile influenzato dalla competizione di crescita e/o dalla pressione terapeutica. 

Fino a poco tempo fa la ricerca si è concentrata su come le mutazioni individuali o le alterazioni del numero di copie del DNA infuiscono sul metabolismo del tumore e creano opportunità terapeutiche. 

Leucemie e gliomi con mutazioni nell'isocitrato deidrogenasi (IDH) sono sensibili agli inibitori mutanti dell'IDH; i tumori con delezioni del gene che codifica per la metiltioadenosina fosforilasi sono sensibili alla deplezione di cisteina; i tumori con delezione di p53 sono sensibili alla deplezione di serina; le leucemie con bassa espressione di asparagina sintetasi o con inibizione della catena di trasporto degli elettroni sono sensibili alla deplezione di asparagina; I tumori RAS-dipendenti sono sensibili alla deplezione di metionina. Altri studi hanno identificato vulnerabilità metaboliche correlate all'equilibrio redox nelle cellule tumorali con disregolazione del pathway PI3K/AKT o sovraespressione dell'antiporter L-glutammato/L-cistina SLC7A11. 

Un recente lavoro eseguito su un pannello di 689 linee cellulari tumorali ha rappresentato la prima caratterizzazione del panorama delle vulnerabilità delle vie metaboliche nelle linee cellulari tumorali. Joly JH e colleghi hanno identificato le vulnerabilità metaboliche, integrando i dati di espressione genica con i dati di screening della perdita di funzione genetica e i dati di screening farmacologici. In questo lavoro, l'attività delle vie metaboliche è stata dedotta dai dati di espressione genica di 689 linee di cellule tumorali sovrapposte tra la Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) e la Cancer Dependency Map utilizzando un set di geni a campione singolo analisi di arricchimento (ssGSEA) dei dati RNAseq da ciascuna linea cellulare normalizzata a tutte le altre linee cellulari (punteggi di arricchimento normalizzati, ssNESs). 

Ricerca proposta 

L'obiettivo generale del progetto è quello di eseguire una caratterizzazione completa delle attività delle vie metaboliche nei tumori di pazienti reclutati in modo prospettico affetti da carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), carcinoma del colon-retto (CRC), carcinoma ovarico (OC), Cancro al seno (BC) e identificare le corrispondenti vulnerabilità metaboliche. 

Questo obiettivo sarà perseguito applicando una pipeline bio-informatica recentemente implementata per l'analisi di linee cellulari e adattata per l'analisi di dati tumorali (Metabolic Pathway and Dependency Algorithm, MeDPA) (nostri risultati preliminari non pubblicati). 

L'algoritmo verrà applicato ai pazienti reclutati per il progetto per determinare le attività delle vie metaboliche sia attraverso l'analisi dell'espressione genica che la misurazione della concentrazione dei metaboliti nei fluidi e/o nei campioni bioptici. 

L'attività delle vie metaboliche sarà successivamente validata negli organoidi stabiliti dagli stessi pazienti e le dipendenze metaboliche dei tumori saranno dedotte dall'algoritmo MeDPA. 

Infine, le dipendenze metaboliche dei tumori saranno validate in colture selezionate di organoidi sulla base delle dipendenze metaboliche identificate, studiando gli effetti di specifici farmaci mirati al metabolismo sulla proliferazione cellulare e/o sulla sopravvivenza negli organoidi. 

Lo Scompenso Cardiaco si verifica quando il cuore dei mammiferi non è più in grado di rimpiazzare efficacemente il tessuto muscolare cardiaco danneggiato o disfunzionale a seguito di un danno. Ciò porta ad un rimodellamento cardiaco sfavorevole e a un deterioramento funzionale. 

Sebbene i cardiomiociti (CMs) vengano costantemente rigenerati durante la vita adulta, questa risposta rigenerativa è limitata e insufficiente per sostituire le cellule perse in seguito a un insulto ischemico miocardico o nelle cardiomiopatie croniche/complesse degenerative non ischemiche. È stato ampiamente dimostrato che i mammiferi neonati, compresi gli esseri umani, nonché molti vertebrati non mammiferi come pesci e anfibi, possono rigenerare integralmente vari tessuti, incluso il cuore. Questa capacità rigenerativa è associata a un sistema immunitario immaturo e al tipo di risposta funzionale dei macrofagi. Infatti, i macrofagi cardiaci residenti identificati per la mancanza dell’espressione del recettore C-C Motif Chemokine Receptor 2 (CCR2-) (CCR2-) e i macrofagi cardiaci residenti/arruolati per via sistemica esprimenti il recettore CCR2 (CCR2+) hanno effetti distinti sul rimodellamento e sulla riparazione cardiaca a seguito di un danno miocardico. La deplezione dei macrofagi cardiaci CCR2+ (pro-infiammatori e profibrotici) prima di un danno ischemico comporta un miglioramento della funzione sistolica del ventricolo sinistro (LV) secondario al miglioramento anatomico del tessuto miocardico. Al contrario, la deplezione dei macrofagi cardiaci CCR2- residenti (anti-infiammatori e pro-rigenerativi) determina una diminuzione della funzione sistolica del LV e modifiche strutturali e anatomiche dannose per il cuore. Questi risultati dimostrano i ruoli differenziali delle diverse popolazioni di macrofagi nella risposta cardiaca al danno e generano l’ipotesi che specifici aspetti della risposta immunitaria/infiammatoria possano significativamente modulare la risposta rigenerativa endogena nel cuore dei mammiferi adulti. Pertanto, l'obiettivo di questo progetto di Dottorato è quello di valutare se i macrofagi cardiaci modulino il rimodellamento cardiaco del ventricolo sinistro (LV) dopo un infarto miocardico inibendo o promuovendo la risposta rigenerativa efficace in modelli murini. Inoltre, utilizzando topi transgenici per eliminare selettivamente i macrofagi cardiaci CCR2+ o CCR2- arruolati a livello sistemico o residenti nel tessuto miocardico, indagheremo se modificare i diversi tipi di risposta funzionale dei macrofagi cardiaci favorisca la rigenerazione miocardica. Infine, esploreremo se i macrofagi CCR2+ e CCR2- abbiano effetti diretti e distinti sull'attivazione delle cellule staminali cardiache (CSC) in vitro ed in vivo. 

Sebbene lo sviluppo di nuovi farmaci abbia migliorato le aspettative di vita e prolungato la sopravvivenza dei pazienti, la cura definitiva del mieloma multiplo (MM), e di numerose discrasie plasmacellulari, rappresenta un “unmet clinical need”, e la ricerca di nuove opzioni terapeutiche rimane di fondamentale importanza soprattutto nelle fasi di recidiva di malattia e/o insorgenza di chemioresistenza. Le cellule di mieloma hanno una particolare plasticità metabolica, ed utilizzano per la loro sopravvivenza, oltre alla glicolisi, vari processi mitocondriali, alcuni dei quali poco caratterizzati. Recenti evidenze del nostro gruppo suggeriscono che i mitocondri funzionino come un network complesso, che definisce la cosiddetta “dinamica mitocondriale”, che consiste in un processo continuo di stati mitocondriali frammentati e fusi. Uno squilibrio tra fissione e fusione è stato identificato in numerosi contesti fisiopatologici ed implicato nel processo di tumorigenesi. Nel contesto delle discrasie plasmacellulari, studi recenti del nostro gruppo supportano il ruolo di alterazioni epigenetiche alla base dell’overespressione dei geni della fissione mitocondriale, e una prevalenza di alterazioni morfologiche compatibili con un aumento della fissione mitocondriale negli stadi avanzati resistenti alle terapie standard con inibitori del proteasoma. Il presente progetto mira a definire l’espressione dei regolatori della dinamica mitocondriale utilizzando modelli preclinici consolidati che riproducono le discrasie plasmacellulari nel contesto del loro microambiente tumorale. Si utilizzeranno approcci di “gain-of-function” e/o “loss-of-function” per studiare gli effetti sulla proliferazione, chemioresistenza e metabolismo dei principali effettori della dinamica mitocondriale in modelli sia in vitro che in vivo. Si implementeranno, infine, approcci mirati di riposizionamento farmacologico, al fine identificare “small molecules” in grado di modulare l’espressione dei principali regolatori della dinamica per i quali al momento non sono disponibili farmaci a bersaglio molecolare.