Nonostante la scienza abbia raggiunto grandi risultati nel campo della prevenzione oncologica, della gestione e del trattamento dei tumori maligni, i tassi di sopravvivenza nella maggior parte delle tipologie tumorali rimangono bassi. Esplorare percorsi biochimici che sono alla base dell’insorgenza tumorale dovrebbe essere una priorità al fine di sviluppare strategie terapeutiche innovative ed efficaci. Come ben sappiamo, il ferro è essenziale per la vitalità cellulare e il mantenimento della salute dell’uomo. L'iperproliferazione delle cellule tumorali induce le stesse a mostrare una maggiore dipendenza dal ferro rispetto alle cellule sane. Per questo motivo, considerare il metabolismo del ferro come bersaglio terapeutico in campo tumorale è un aspetto emergente. Usare chelanti del ferro è una strategia in espansione volta a sequestrare il ferro indispensabile per le cellule tumorali. In alternativa, essendo il sovraccarico di ferro la causa di una forma di morte cellulare regolata nelle cellule tumorali, potrebbe anche questa essere una strategia anticancro alternativa. 

Il contributo delle proteine BET nella progressione del cancro è stato ampiamente riportato nella letteratura scientifica. La famiglia di proteine BET (proteine con un bromodominio ed un dominio extraterminale) può interagire con gli istoni acetilati e reclutare fattori di trascrizione. Essendo cruciali nella regolazione trascrizionale, queste proteine possono controllare la progressione tumorale. Gli inibitori a piccole molecole di prima generazione progettati per queste proteine BET, ​​sono stati sviluppati per reprimere la proliferazione delle cellule tumorali. Poiché alcune cellule tumorali sfuggono all'apoptosi indotta proprio da questi inibitori BET, ne deriva il fallimento del trattamento stesso. Lo scopo di questo progetto è lo studio della correlazione tra il metabolismo del ferro e le proteine ​​della famiglia BET per scoprire nuovi farmaci o modelli al fine di superare gli ostacoli associati ai trattamenti che possono insorgere con gli inibitori BET. Durante il programma di dottorato, lo studente acquisirà un'elevata competenza in tecniche all'avanguardia nel campo della biologia molecolare e cellulare, come l'imaging cellulare e 3D, la citometria a flusso e l'espressione genica (dalla RT-PCR al RNA-sequencing). I risultati di questo studio metteranno in evidenza l'importanza di sviluppare terapie efficaci ed innovative al fine di migliorare l’efficienza della chemioterapia tradizionale e superare la resistenza ai farmaci.

Il mantenimento dell’Integrità genomica è un evento chiave nei processi di tumorigenesi. In risposta al danno al DNA (DDR), le cellule attivano una serie di eventi che portano all’attivazione dei meccanismi di riparo. Recentemente, è stata osservata una chiara relazione tra i pathway di riprogrammazione metabolica ed i processi di danno e riparo del DNA. Entrambi i processi risultano attivati in modo aberrante in molti tipi di tumore soprattutto nei tumori del pancreas e della mammella. 

L’aumento della glicolisi aerobica e l’attivazione delle vie metaboliche connesse sono eventi chiave nei processi di trasformazione neoplastica. In tale contesto il glucosio è indirizzato alla via delle esosammine (HBP), un pathway essenziale per la sintesi dei substrati di O-glicosilazione e determinante nei processi di sopravvivenza cellulare. In concomitanza l’alto flusso glicolitico induce stress carbonilico ed un aumento del metilgliossale (MGO), un metabolita tossico che altera le dinamiche cromatiniche ed interferisce con i processi di riparo del DNA.  Poiché entrambi i processi sono glicolisi-dipedendenti e sono relazionati tra loro e con i pathway di DDR, tale progetto mira a delucidare:i) il ruolo del pathway delle esosammine nei processi di riparo; ii) l’impatto dei livelli di MGO nelle dinamiche cromatiniche; il network di interazioni tra i due processi glicolisi dipendenti e DDR. Tale ipotesi, in relazione ai nostri precedenti studi, suggeriscono che l’analisi approfondita dei fenomeni potrebbe essere utile per l’identificazione di nuovi bersagli terapeutici per colpire selettivamente il cancro. 

La paralisi sopranucleare progressiva (PSP) è una condizione neurodegenerativa caratterizzata dall'accumulo nel cervello di una forma specifica di proteina tau, nota come isoforma a quattro ripetizioni (4R). Ciò porta alla formazione di accumuli neurofibrillari all'interno dei neuroni (NFTs), degli astrociti (TAs) e degli oligodendrociti (CB). La forma clinica predominante di PSP, riconosciuta come sindrome di Richardson (PSP-RS), è caratterizzata da sintomi quali la compromissione oculomotoria verticale e instabilità posturale. La maggior parte dei casi di PSP è sporadica e i fattori di rischio genetici più comuni sono associati a varianti della proteina associata al microtubulo. Nonostante i numerosi studi clinici condotti di recente che hanno testato nuovi farmaci modificatori della malattia che hanno come bersaglio la proteina tau nella PSP RS, nessuno ha raggiunto gli endpoint primari. Le attuali conoscenze biologiche sulla PSP si sono basate principalmente su tessuti cerebrali post-mortem, concentrandosi quindi sullo stadio avanzato della malattia; manca dunque un'indagine sistematica sulla fisiopatologia della PSP allo stadio iniziale. Di conseguenza, esiste un gap significativo nella comprensione della progressione della malattia, in particolare nelle sue fasi iniziali, impedendo lo sviluppo di terapie mirate che potrebbero potenzialmente intervenire nelle fasi precoci della malattia. Gli organoidi cerebrali derivati da iPS sono emersi come un potente strumento in grado di ricapitolare le caratteristiche architettoniche e funzionali del cervello umano, offrendo un solido modello in vitro per lo studio dei disturbi neurologici. Tuttavia, il raggiungimento di una riproducibilità sperimentale coerente è ostacolato dalla differenziazione di più linee iPSC umane, complicata da fattori quali la variabilità dei donatori, le variazioni genetiche e le discrepanze sperimentali. I chimeroidi del mesencefalo rappresentano un modello di organoide cerebrale umano multi-donatore robusto e riproducibile, creato co-differenziando cellule di diversi pazienti all'interno di un unico organoide. I nostri dati preliminari indicano che i chimeroidi sono in grado di replicare le caratteristiche istologiche della PSP come mostrato dalla presenza di accumulo di proteina tau iperfosforilata, predominanza di 4R-tau, aumento delle cellule GFAP-positive. Inoltre, i chimeroidi della PSP mostrano la presenza di NFT e TAs e sono caratterizzati da processi poco ramificati e sottili di cellule immunoreattive alla tirosina idrossilasi (TH). Ulteriori ricerche saranno necessarie per lo studio molecolare della malattia. In particolare, sarà condotta un’analisi di sequenziamento dell’RNA di una singola cellula (scRNA-seq) che consentirà di identificare specifici marcatori cellulari e di comprendere le loro funzioni. Questo approccio mira a migliorare la nostra comprensione dell'intricata e complessa rete che guida la progressione della PSP. A complemento di ciò, il profilo proteomico dei chimeroidi della PSP e controlli sani sarà analizzato mediante la spettrometria di massa. Infine, l'analisi elettrofisiologica funzionale dei neuroni di soggetti malati e di individui sani concluderà il processo di acquisizione sistematica dei dati. Nell’insieme queste analisi mirano a identificare il profilo molecolare alla base della PSP, consentendo così di avanzare la ricerca neurologica e facilitando lo sviluppo di terapie di precisione. 

L'obiettivo principale di questo progetto di dottorato è sviluppare e caratterizzare nuove cellule T ingegnerizzate per il trattamento dei tumori solidi. Nonostante i significativi progressi nell'immunoterapia del cancro, i tumori solidi presentano sfide uniche a causa del loro microambiente immunosoppressivo e delle barriere fisiche. Questo progetto mira a affrontare queste sfide utilizzando tecniche avanzate di ingegneria genetica per migliorare la funzionalità e la specificità delle cellule T contro gli antigeni dei tumori solidi. Gli obiettivi del progetto sono definiti come segue: 

• Identificazione di recettori di cellule T (TCR) diretti verso antigeni specifici del tumore (TSAs) e antigeni associati al tumore (TAAs) espressi in vari tumori solidi, con aplotipo HLA noto. 
• Creazione e validazione di vettori per l’espressione dei suddetti TCR in cellule T purificate. 
• Utilizzare CRISPR-Cas9 e altre tecnologie di editing genetico per inserire, eliminare o modificare geni nelle cellule T per migliorare la persistenza delle cellule T, la resistenza all'immunosoppressione e il traffico verso i siti tumorali. 
• Caratterizzazione funzionale in vitro delle cellule T ingegnerizzate (citotossicità, la proliferazione, la produzione di citochine e la sopravvivenza) 

Ottimizzazione della produzione di cellule T ingegnerizzate: sviluppare protocolli scalabili e riproducibili per l'espansione e la purificazione delle cellule T ingegnerizzate. 

Questo progetto ha il potenziale di avanzare significativamente il campo dell'immunoterapia del cancro fornendo nuove opzioni terapeutiche per i pazienti con tumori solidi. Lo sviluppo riuscito di queste cellule T ingegnerizzate potrebbe portare a trattamenti più efficaci, migliorare i risultati per i pazienti e approfondire la comprensione dell'interazione tra cellule immunitarie ingegnerizzate e il microambiente tumorale

Background 

Il cancro del colon-retto (CRC) è la terza neoplasia più diffusa in Italia con circa 35.000 nuovi casi all’anno. Sebbene negli ultimi anni l’approccio alla terapia del CRC si sia spostato verso una terapia mirata (es. l’inibizione dei recettori dei fattori di crescita), questa strategia terapeutica è limitata dal fatto che i marcatori per la selezione dei pazienti e i target specifici di terapia clinicamente validati sono pochi. Attualmente lo standard terapeutico è ancora basato principalmente sulla chemioterapia (I e II linea) la cui efficacia è spesso limitata dall’insorgenza di resistenza. Le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione, sulle quali si sono basati i progetti di consorzi come The Cancer Genome Atlas (TCGA), hanno identificato migliaia di mutazioni e fusioni uniche tra vari tipi di cancro, ma solo una frazione di queste varianti è stata caratterizzata funzionalmente. Alla luce di ciò, una sfida fondamentale nello sviluppo e nell’implementazione di terapie antitumorali e nel miglioramento della cura dei pazienti è quella di distinguere le mutazioni “driver” causali dalle varianti “passenger” non patogene e chiarire i loro meccanismi oncogenici. Pertanto, esiste un urgente bisogno di caratterizzare funzionalmente le varianti tumorali di significato sconosciuto (VUS) in modo sistematico, così da chiarire sia il loro contributo allo sviluppo del cancro e sia le loro proprietà teranostiche per una terapia mirata. 

Scopi 

L'obiettivo del progetto di ricerca proposto consiste nella validazione funzionale di una serie di nuove varianti somatiche con significato incerto (VUS), già identificate dal nostro gruppo di ricerca in una coorte di 36 pazienti con cancro del colon-retto, determinando il loro effetto sulla funzione proteica e di conseguenza il loro ruolo nella patogenesi del CRC. 

Metodi 

Il nostro gruppo di ricerca ha già condotto un'analisi NGS per l'identificazione dei geni coinvolti nell'insorgenza e/o nella resistenza ai farmaci del CRC, utilizzando il pannello ad ampliconi AmpliSeqTm Comprehensive Cancer Panel che consente il sequenziamento dell'intera regione codificante di 409 geni associati a tumori. Questa analisi ha identificato varianti potenzialmente patogene in circa 350 geni, inclusi i geni che codificano per i recettori tirosin chinasici appartenenti alla famiglia dei recettori FGF (FGFR2, 3 e 4). In particolare, il gene FGFR2 è risultato essere mutato in 3/36 tumori (9%), mentre i geni FGFR3 e FGFR4 ciascuno in 7/36 tumori (20%). Queste mutazioni erano presenti esclusivamente nel tessuto tumorale e annotate come “dannose”, quindi potenzialmente oncogene, da due diversi software di predizione strutturale e funzionale delle proteine (Sift, Poliphen). Le sequenze wild-type di FGFR2, FGFR3 e FGFR4 verranno clonate in appropriati vettori di espressione plasmidici. Una volta clonate, le nuove mutazioni identificate nella coorte di pazienti verranno riprodotte nella sequenza codificante dei geni mediante un approccio di mutagenesi sito-specifico. Le mutazioni saranno testate mediante saggi di vitalità cellulare in vitro dipendenti da fattori di crescita (mutazioni vs wild-type) utilizzando i modelli cellulari Ba/F3 e MCF10A. Sulla base di questi risultati, la mutazione verrà annotata in tre diverse categorie funzionali: positiva (maggiore vitalità cellulare), nessun effetto e negativa (minore vitalità cellulare). Verrà valutato il livello di concordanza tra le annotazioni funzionali risultanti con le predizioni effettuate dai principali algoritmi computazionali 3D. Infine, verrà condotto un profilo proteomico funzionale delle mutazioni selezionate mediante array di proteine a fase inversa (RPPA) con l'obiettivo di identificare aberrazioni delle vie di segnalazione che stanno a valle delle mutazioni. 

Risultati attesi 

Ci aspettiamo di caratterizzare funzionalmente le varianti a significato sconosciuto (VUS) identificate in pazienti con cancro del colon-retto, al fine di identificare mutazioni “driver” che potrebbero avere effetti funzionali sullo sviluppo del cancro e sulla risposta ai farmaci (gli FGFR sono potenzialmente coinvolti nella resistenza ai farmaci e specifici inibitori della chinasi, come il dovitinib, sono attualmente oggetto di sperimentazione in studi clinici). Inoltre, l’identificazione di eventuali aberrazioni delle vie di segnalazione dipendenti dalle mutazioni, che verranno saggiate mediante profilo proteomico, ci aspettiamo di ottenere altri bersagli azionabili suscettibili ad una terapia mirata. 

Il nostro progetto di ricerca si concentra sull'interazione tra dinamiche di crescita tumorale, metabolismo lipidico e infiammazione nelle linee cellulari normali e tumorali, con particolare attenzione al ruolo di FABP5 e NF-κB. Esamineremo il mesotelioma pleurico maligno (MPM), il tumore alla prostata e il tumore epatico, noti per la loro complessità molecolare e resistenza ai trattamenti. La nostra ipotesi è che FABP5, un trasportatore di acidi grassi, contribuisca alla regolazione del metabolismo lipidico e all'attivazione di NF-κB, promuovendo la crescita tumorale e un ambiente infiammatorio. Utilizzeremo tecniche di silenziamento genico e analisi metaboliche per valutare gli effetti di FABP5 su proliferazione, apoptosi e metabolismo nelle linee cellulari di mesotelioma, prostata, epatiche e mesoteliali normali. I risultati potrebbero rivelare FABP5 come un potenziale bersaglio terapeutico, aprendo nuove prospettive per trattamenti innovativi contro diverse tipologie di tumori. 

Il campo della glicoprotemica ha fatto enormi progressi negli ultimi anni e promette di fornire significativi contributi nel campo dei marcatori tumorali. Fino a poco tempo fa, l'analisi dei glicani e la caratterizzazione dei siti di glicosilazione sulle proteine erano due approcci paralleli che si basavano su metodologie diverse. Oggi, l'analisi diretta dei glicopeptidi intatti è resa possibile dai progressi fatti nel campo della strumentazione analitica, in particolare nella spettrometria di massa (MS) e nel campo dell'analisi dei dati MS. 

Il candidato svilupperà protocolli per l'arricchimento di glicopeptidi su biglie magnetiche (biossido di titanio, cromatografia a interazione idrofila, funzionalizzazione con acido boronico) e per l'analisi MS dei glicopeptidi in modalità data-independent acquisition (DIA). Questa ultima modalità di scansione ha prodotto enormi progressi nella proteomica “whole cell” nell'ultimo decennio ed ha un potenziale ancora largamente inesplorato in glicoprotemica. I nuovi protocolli sviluppati dal candidato per la glicoprotemica saranno applicati all'analisi dei glicopeptidi di un set di campioni di interesse nel campo dell'oncologia (fluido biologico o tessuto tumorale).